Отправлено: 13.01.09 22:32. Заголовок: Холявка М.Г., Беленова А.С. Разработка новых биокатализаторов...
Тема: Разработка новых биокатализаторов с целью получения обогащенных фруктозой сиропов, глицерина и органических кислот Холявка М.Г., Беленова А.С. Воронежский государственный университет, Россия, Воронеж
Осуществлена иммобилизация инулиназы на ионообменной смоле АВ-16-ГС и липазы на АВ-17-2П различными методами. Применение модифицированного глутаральдегидного метода иммобилизации обеспечивает повышение каталитической активности препарата инулиназы, по сравнению с обычным глутаральдегидным методом, и позволяет сохранить до 85 % каталитической способности свободного энзима. Иммобилизованная на АВ-17-2П липаза сохраняет 23 % активности по сравнению с нативной формой фермента.
Инулиназы различного происхождения расщепляют инулин и другие фруктозосодержащие полимеры до фруктозы, воздействуя на гликозидные связи. Инулиназа (2,1-β-D-фруктан-фруктаногидролаза, КФ 3.2.1.7) широко распространена среди высших растений и микроорганизмов. Данный энзим может использоваться для получения фруктозы из растительного сырья: топинамбура, георгина, девясила, цикория, одуванчика, лопуха. В настоящее время производство фруктозы из крахмала ферментативным путем состоит из нескольких этапов и требует наличия трех различных ферментов: α-амилазы, глюкоамилазы и глюкозоизомеразы. При этом получают 45 % фруктозный сироп. В случае применения инулиназы для расщепления инулинсодержащего сырья в одностадийном процессе получают конечный продукт – 95 %-ный фруктозный сироп. Липаза (КФ 3.1.1.3) расщепляет триглицериды на глицерин и жирные кислоты. Липолитические препараты входят в состав ряда лекарственных средств, таких как «Фестал» и «Мезим», их добавляют в чистящие средства, используют в кожевенной промышленности, сыроделии, хлебопечении. Объектами исследований послужили инулиназа Aspergillus awamori BKMF 2250 и липаза Rhizopus japonicus 1403. Особенности экстракции и очистки ферментов, а также схемы и протоколы очистки представлены в [1, 2]. Содержание белка определяли методом Лоури, каталитическую активность измеряли спектрофотометрически на фотоэлектроколориметре КФК-3 (Россия). В качестве носителей для иммобилизации ферментов использовали анионообменные смолы АВ-16-ГС и АВ-17-2П. Выбор этих полиэлектролитов обусловлен тем, что они прошли санитарно-химическую оценку и получено разрешение на их применение в пищевой промышленности и для очистки воды. Подготовку ионитов к иммобилизации осуществляли путем кондиционирования и перевода в нужную ионообменную форму. Для проведения сорбционной иммобилизации 5 г носителя оставляли на ночь при комнатной температуре в 50 мл ацетатного буфера (рН 4,5). К суспензии ионита добавляли 5 мл раствора фермента и перемешивали в колбе с помощью электрической мешалки в течение 1,5 часов при 25 ºС, далее центрифугировали 5 мин при 250 g. Для проведения ковалентной иммобилизации глутаральдегидным методом 2,5 г смолы оставляли на сутки при комнатной температуре в 20 %-ном растворе глутарового диальдегида в соотношении 1:1 с закрытой пробкой. Далее носитель отмывали дистиллированной водой, добавляли 2,5 мл раствора фермента (рН 4,5) и инкубировали в течение суток в закрытом сосуде. Иммобилизованный препарат, полученный в ходе сорбционной и ковалентной иммобилизации промывали ацетатным буфером до отсутствия в промывных водах белка. Контроль осуществляли на спектрофотометре СФ-46 при λ=280 нм. В целях повышения каталитической активности энзимов мы использовали модифицированный глутаральдегидный метод. Эксперимент проводили по следующей методике: к 2 г анионита добавляли 45 мл 4 %-ного раствора янтарного ангидрида в хлороформе и кипятили на водяной бане с обратным холодильником 4,5 часа, далее смесь инкубировали еще 16 часов при комнатной температуре. Смолу промывали теплым хлороформом и сушили на воздухе, затем добавляли 10 мл хлористого тионила и кипятили 30 минут. К промытому толуолом и высушенному носителю по каплям добавляли 20 мл этилендиамина, поддерживая температуру 20 °С, смесь стояла 20 часов, 10 раз ее промывали дистиллированной водой, 5 раз – раствором аммиака (3 %) и снова водой. К иониту добавляли 10 мл раствора глутарового альдегида (2 %) и перемешивали с помощью магнитной мешалки 3 часа при 50 °С. После этого смолу отделяли от раствора, промывали водой и инкубировали с раствором фермента, согласно вышеприведенной методике. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили, используя пакет программ «Statgraphics». Показано, что иммобилизация инулиназы на анионообменной смоле АВ-16-ГС любым из исследуемых методов приводит к сдвигу оптимальной температуры катализа в сторону более высоких значений (от исходных 50 °C до 70-75 °C) и расширению диапазона оптимальных значений рН. Применение модифицированного нами глутаральдегидного метода иммобилизации инулиназы обеспечивает повышение каталитической активности препарата, по сравнению с обычным глутаральдегидным методом, и позволяет сохранить до 85 % каталитической способности свободного энзима. Иммобилизованная на АВ-17-2П липаза сохраняет 23 % активности по сравнению с нативной формой фермента. Оптимальная температура гидролиза триглицеридов повышается на 3 °С (до 40 °С), оптимум рН сдвигается вправо на 0,5 единиц и составляет 7,0. Эти данные позволяют нам сделать вывод, что при ковалентном связывании инулиназы и липазы с матрицей исследуемых нами анионитов повышается термостабильность энзимов и происходят изменения в состоянии ионизации отдельных компонентов ферментативной реакции.
Список литературы 1. Ковалева Т.А. Физико-химические и кинетико-термодинамические аспекты катализа свободными и иммобилизованными амилазами: дис. … д-ра биол. наук : 03.00.02 / Т.А. Ковалева. – Воронеж, 1998. – 421 с. 2. Трофимова О.Д. Исследование молекулярного механизма реакции ферментативного гидролиза триглицеридов: дис. … канд. биол. наук : 03.00.02 / О.Д. Трофимова. – Воронеж, 2004. – 156 с.
Авторы выражают признательность профессору, д.б.н. Ковалевой Т.А. за помощь в подготовке работы
Все даты в формате GMT
7 час. Хитов сегодня: 6
Права: смайлы да, картинки да, шрифты да, голосования нет
аватары да, автозамена ссылок вкл, премодерация откл, правка нет
- участник сейчас на форуме
- участник вне форума